SN∕T 1705-2021 国境口岸森林脑炎检验方法
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ID： |
AA374925045946959C2000C5D99FED28 |
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文件大小(MB)： |
0.3 |
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页数： |
12 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-10-24 |
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准,SN/T 1705—2021,代替SN/T 1705— 2006,国境口岸森林脑炎检验方法,Examination method for tick-borne encephalitis at entry-exit port,中华人民共和国海关总署发 布,ICS 11.020,CCS C 62,2021-06-18 发布2022-01-01 实施,I,SN / T 1705— 2021,前 言,本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规,定起草,本文件代替SN/T 1705— 2006《出入境口岸森林脑炎检验规程》,本文件与SN/T 1705— 2006 相比，主要技术变化如下：,——增加了7.4“实时荧光RT-PCR 检验”,本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口,本文件起草单位：中华人民共和国长春海关,本文件主要起草人：杨怀宁、王玮琳、谢忠伟、丁旭、马文晨、杨迪、宋屿竹,本文件所代替标准的历次版本发布情况为：,—— SN/T 1705— 2006,1,SN / T 1705— 2021,国境口岸森林脑炎检验方法,1 范围,本文件规定了出入境口岸森林脑炎检验规程，包括检验方法、结果报告、阳性结果处置,本文件适用于出入境口岸森林脑炎的实验室检测,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文,件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适,用于本文件,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1,森林脑炎 tick-borne encephalitis；TBE,由黄病毒科黄病毒属中森林脑炎病毒经硬蜱叮咬所致自然疫源性急性中枢神经系统传染病，又,称苏联春夏脑炎和远东脑炎。临床特征是突发高热、意识障碍、头痛、项强、上肢与颈部及肩胛肌瘫,痪，后遗症多见,3.2,酶联免疫吸附法 enzymelinked immunosorbent assay；ELISA,将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应,的定性和定量检测方法,3.3,间接免疫荧光 indirect immunofluorescence,直接免疫荧光技术的改进。待检细胞首先用未标记的抗体处理，使之与特异的抗原形成复合,物，然后再用抗体的荧光标记抗体着色，即可检测出特异抗原在细胞中的存在部位，具有荧光增,强效应,3.4,实时荧光定量PCR quantitative real-time PCR,real-time RCR 是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR 扩,增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据,4 生物安全,实验室生物安全应符合GB 19489（所有部分）中的规定。PCR 防污染措施按照WS/T 230 确定的,2,SN / T 1705— 2021,要求进行,5 仪器设备,5.1 含FAM、HEX、Tecas Red、CY5 四种荧光检测通道的实时荧光PCR 仪,5.2 生物安全柜,5.3 普通冰箱,5.4 70 ℃超低温冰箱,5.5 普通台式离心机,5.6 荧光显微镜,5.7 酶联免疫测定仪,5.8 微量移液器（10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL）及配套带滤芯吸头,5.9 离心管（1.5 mL、2 mL）,6 样本处理,6.1 血液样本,血液样本采集后，用生物安全箱在冷藏的条件下迅速送往实验室，当日分离血清,6.2 蜱样本,采集的蜱先冰冻，然后将每个蜱分别置于5 % 的Chelex100 树脂溶液中（每个若虫置于200 μL 溶,液中，每个成虫置于500 μL 溶液中）。每次在一个试管中用锋利的手术刀片切一个蜱，蜱的成虫切成,4 块～6 块，若虫切成2 块～4 块，此过程要在液面以下进行，手术刀片在切下一只蜱之前要用火焰,消毒。含有样品的试管经涡轮振荡后于56 ℃孵育过夜，随后将样品在98 ℃～100 ℃孵育15 min，涡,轮振荡10 s，冰浴并离心，取上清作检验,7 实验室检验方法,7.1 间接免疫荧光检验,将处理后样本按商品化试剂盒的说明书操作，下面以商品化试剂盒TBE 抗体（IgG，IgM）间接,免疫荧光法检测试剂盒为例：,a） 将加样板放在操作台上，按顺序分别滴加25 μL 稀释后血清至加样板的每一反应区，避免产,生气泡。加完所有待测标本后再开始温育（最多200 份）;,b） 将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一样品均在,生物薄片接触且样品间互不接触。室温（18 ℃～25 ℃）温育30 min;,c） 用烧杯盛PBS 吐温缓冲液流水冲洗载片1 s，然后立即将其进入装有PBS 吐温缓冲液的洗杯,中浸泡至少5 min。有条件的情况下可用旋转摇床进行振荡;,d） 滴加20 μL FITC 标记的抗人IgG 或IgM（荧光二抗）至洁净加样板的反应区，完全加完所有,的荧光二抗方可进行下一步温育。建议使用连续加样器。FITC 标记的抗人IgG 或IgM 使用,前需混匀。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加二抗至另一个加样板的反应区;,e） 从洗杯中取出一张载片，5 s 内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹,槽内；,注： ……
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